哺乳动物（包括人类）造血发生均源于中胚层（mesoderm），主要可分为原始造血（primitive hematopoie sis ）和成体造血（definitive hematopoiesis）。已知造血发生最早起源位点为卵黄囊（Yolk sac）， 相当于小鼠胚胎7.5天（E7.5），属原始造血，只能分化为髓系及红系的少数几种细胞类型，无淋系发育。其产生的红细胞体积较大且不脱核，主要表达胚胎型血红蛋白。成人血细胞的造血发生过程称为成体造血，很可能最初产生于胚胎主动脉/性腺/中肾（aorta/gonad/mesonephros，AGM）区域（E8.25），至妊娠中后期胎儿肝脏（E11.5）及胸腺（E14.5）成为血细胞产生的主要位置，然后转移至胎儿骨髓（E16.5），出生后骨髓成为永久造血中心。

  最新研究表明，在原始造血和成体造血间，还有一些其他来源的与造血干细胞类似的细胞产生，分布于头部、尿囊、脐带/胎盘等区域，其血细胞特征类似成体造血，但不是成体造血的直系祖先，而在胚胎晚期消失。由此形成“三个波次”的造血发生理论。但详尽的血液细胞发生谱系仍未被清晰阐明。特别是起源于中胚层的造血发生最初是多点起源还是单点起源，三个波次造血起源是否有前后继承关系，前两个波次与最后成人体内造血的起源关系，都需进一步澄清。

  目前大多数造血发生机制均源于小鼠模型的造血研究，但由于人和小鼠在造血发生机制方面存在一定差别，其造血生理机制不能直接套用于人类。人类造血发生机制研究由于伦理及操作原因进展较为缓慢，也难以深入。

  人类胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC） 分离培养技术和成体细胞重编程技术的发明，使得hESC/诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）—统称为人类多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）—成为体外分化培养体系的重要起始细胞来源。利用体外共培养办法来进行血细胞分化的尝试已取得重大进展，从小鼠AGM区域及脑颅区域分离的AGM-S3和及OP9基质细胞系可诱导hESC/hiPSC分化得到很多类型血细胞及免疫细胞，不但为体外生产这些细胞提供了可能性，也为研究造血分化的分子调控机制提供了良好研究模型。

  采用小鼠胚胎AGM区域来源的基质细胞系AGM-S3，AGM培养系统最大限度地模拟了成体造血发育最初的微环境，其产生的血细胞接近成体类型，研究者可在体外观察接近于人类真实造血分化过程中的每一个步骤和环节，这是研究其分子调控机制最好的研究模型之一，同时也是造血分化关键基因筛选的最好体系，还可筛选对造血有推动作用的单一化合物以研发生血药物。最近人类AGM基质细胞系的建立，使得这个体系更接近人类真实的造血发生环境。

  OP9培养系统是最广泛应用的体外造血分化体系，通过OP9细胞系中转基因过表达DLL1及DLL4 基因，已建立了专门用于分化T细胞和红细胞的基质细胞系。由于没知识产权限制，OP9细胞系可自由进行基因工程改造以提高特定血细胞及免疫细胞造血分化效率，利于人工血细胞的大规模生产。

  此外， 基于细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 或纳米材料无滋养层细胞体系也在蒸蒸日上中，以多种基质蛋白为基础的培养体系可高效诱导hESC向造血分化。本课题组最近应用胶体自组装模式材料（cSAPs）成功刺激hESC造血潜能的提高，在后续AGM体系中能轻松的获得2~7倍的各类造血祖细胞及血细胞，显示出纳米材料在这方面的良好潜能。本课题组正在揭示相关详细分子机制，并试图在以往无滋养层血细胞分化体系中引入纳米材料，以期得到更好造血分化效率。

  三、体外造血发生体系产生的造血干/祖细胞、末端分化血细胞及免疫细胞应用于临床所面临的主要问题

  这些体外造血分化体系的最新进展，显示了其成为未来人造血细胞及免疫细胞制造工厂的巨大潜力。未来hiPSC取代hESC作为初始材料，完全摆脱医学伦理对人类胚胎应用的限制，并实现个体精准化治疗；同时也摆脱对人类细胞来源的限制，可无限量提供初始细胞。但这些体系并非完美无缺，也存在一些重大瓶颈问题，极大限制了其在临床的应用。

  首先遇到的是造血分化效率问题。目前无论AGM系统、OP9系统还是无滋养层培养系统，其单位数量hESC所能分化的造血干/祖细胞、各类血细胞祖细胞及末端分化血细胞/免疫细胞的数量都相当有限。其中最大的问题是人工红细胞和血小板（前体是巨核细胞）的产量不足。由于人类体内红细胞和血小板周期短，输血需求巨大，使得体外生产相关的人工血细胞在规模和经济性上远不能够满足临床需求，也使得其无法代替献血成为人类血液主要来源。

  另一个重要问题是血细胞品质不足。理论上讲，体外造血分化体系可分化出所有种类的血细胞/免疫细胞及其祖细胞。就祖细胞而言，人类造血干细胞（hHSC）是体外造血分化体系所希望分化的最具有临床应用价值的细胞类型，可替代骨髓移植治疗各种遗传疾病及癌症。但至今没有体外体系能成功诱导hESC分化出hHSC并被鉴定具有可完全重建造血体系的功能。在末端分化细胞方面，诱导hESC分化得到的人工红细胞品质问题最大，其表达的血红蛋白更接近胚胎型血红蛋白（γ和ε型）而不是成体型血红蛋白（α和β型），同时脱核率很低，使得大量输注人工红细胞会面临携氧载体不匹配及致癌性的潜在风险。这些都极大地限制了人工血细胞的临床应用。

  为彻底解决体外造血分化体系产生血细胞应用于临床的困难，明确真实造血发生过程的调控机制并找到关键性瓶颈极为必要。血细胞品质问题同各种末端分化血细胞及其祖细胞的具体发育微环境紧密关联，具有各自问题特点，需要分别逐一进行探索。造血分化效率低下则带着普遍性问题，是所有血细胞分化都面临的困难。为探索人类造血发生的普遍规律，找到难以提高造血分化效率的症结所在，笔者所在课题组最近做了一些有益探索。

  笔者所在课题组最初的研究选择了成体造血发生中最关键的调控基因RUNX1 。已有报道显示，RUNX1一个异构体RUNX1a的过表达会强烈刺激造血分化。笔者所在课题组首先构建了与AGM-S3体系相配套的基于piggyBac转座子的PB-Tet-on-OE载体系统，与传统的慢病毒系统相比，这个系统能够在hESC培养过程及造血分化过程中高效持久表达目的基因，利用其GFP标签可很灵敏地探测过表达目的基因细胞群的造血效率，这都极大方便了后续工作。在造血分化过程中的不同时期诱导过表达了RUNX1的所有主要异构体RUNX1a/b/c/205， 发现在AGM-S3体系中，除了RUNX1a以外，其他异构体过表达都造成了类似效应：当在早期（D0-D2）过表达RUNX1异构体时，会极大抑制造血发生；当在后期（D8-D10） 过表达RUNX1异构体时，则会极大促进造血发生。其他一些造血相关基因，包括HOX基因家族成员（如HOXA9和HOXC4）， 及细胞周期抑制因子（CKIs，如P15、P18和P21等）在早期过表达同样会强烈抑制造血发生；而HOXA9 、HOXC4 、P18等基因在后期过表达也会强烈刺激造血发生。以上结果为这些造血相关基因在不同时期过表达会产生完全不同的效应。

  为更清晰探索效应背后的分子机制，笔者所在课题组进行了大规模小分子抑制剂/激活剂的筛选，结果发现这些基因早期过表达以后，共培养细胞的TGF-β信号有明显提升，而对该信号通路的抑制可很大程度缓解其对造血的抑制效应。后期过表达这些基因后，共培养细胞的NF-κB信号显著提升，抑制该信号通路则完全消除了其刺激造血的效应。这说明TGF-β及NF-κB信号通路很可能深度参与了早期抑制造血效应或后期促进造血效应。（图1）

  图1 与造血发生紧密关联的重要基因及信号通路在不同共培养阶段的上调或下调对造血发生效率的影响和相互关系概念图

  笔者所在课题组初步探索发现早期控制造血发生效率的关键是TGF-β 信号通路，RUNX1b过表达上调了TGF-β信号，后者又诱导了P15及P21表达（很可能还有P18），RUNX1-TGFβ-CKIs级联强烈的负调控早期造血分化效率。其生理意义可能在于，早期发育中静止的胚胎并不是特别需要太多的血液细胞来供氧，因此血液细胞的产生受到严控。而RUNX1基因在胚胎发育早期对造血发生有着很强的推动作用，过高的RUNX1b表达水平很可能会引起过多血细胞产生，并造成不利生理效应，也浪费了有限发育资源。作为造血发生规模的控制阀门，TGF-β信号因RUNX1b过表达上调，并引发下游CKI基因表达，抑制造血发生，这样就把早期胚胎的造血规模牢牢控制在一个合理有限范围内而不会过高。

  当体外体系进行造血发生时， 这套内在的调控机制仍在起作用，因此极大限制了过表达RUNX1等促进造血基因对早期造血的刺激作用，从源头上就限制了体外体系整体造血发生效率。若能够利用TGF-β信号通路抑制剂及其他遗传学方法打开这个阀门，让造血发生不再受到RUNX1-TGFβ-CKIs限制， 那么很可能可以让造血规模指数级增长，相当于上游打开了闸门，下游各种血细胞的产量都有可能急剧增加。当然笔者所在课题组也发现，尽管TGF-β信号通路抑制剂能够强烈促进早期CD34low CD43-细胞群的产生， 但RUNX1b的过表达对下游CD34highCD43-、CD34+CD43+及CD34+CD45+细胞群的抑制没有明显改善，说明还有其他可能机制在抑制造血规模，有待于进一步探索。

  NF-κB信号通路是调控造血分化效率的另一个关键信号通路。笔者所在课题组发现所有后期过表达能够促进造血的基因，它们的促进效应都伴随着该信号提升，并且这些效应都能因该通路的抑制完全抵消。甚至在纳米材料提升hESC造血分化潜能的实验中，类似的现象也存在。这些证据显示NF-κB信号通路在造血分化后期（D8）成为一个提升造血分化效率所要涉及的关键通路。如果能够以恰当方式刺激或改变NF-κB信号通路，或许就能直接提升造血分化效率，而无需操作众多相关基因，这可能是一条相对便捷的技术路线。

  此外，笔者所在课题组最近还进行了基于慢病毒敲除文库的大规模功能基因筛选，发现hESC中很多神经分化相关基因被敲除以后造血分化效率有了很大提高。当hESC向造血分化时，与之竞争的应该主要是向神经方向分化，如果能够通过敲除这些神经分化关键基因来阻断其向神经方向的分化途径，那么就有极大可能提高造血分化效率。笔者所在课题组正将筛选出来的基因进行逐一验证，其中效果明显的基因可联合起来应用于hESC的基因修饰来大幅度提高造血分化效率，相信应该是一个很好的研究思路。

  笔者所在课题组通过一系列基因诱导过表达实验，找到了造血发生早期和后期重要的调控因子：TGF-β和NF-κB信号通路，并初步查明了其影响造血发生效率的方式。推测如果能够以正确方式影响这两个信号转导通路，就有可能彻底打破现有体外造血分化体系分化效率的瓶颈。同时，阻止hESC向神经方向的分化很可能会强烈促进其向造血分化趋势，极大提高造血分化效率。相信在未来探索中，笔者所在课题组能利用这些线索，找到突破现有体外分化体系瓶颈的办法，实现人工血细胞的大规模工业化生产，使其成为人类血液的一种有效替代品，最大限度满足临床及紧急状况下大量输血需要；同时也能满足细胞免疫疗法、干细胞疗法及基因治疗对人工血细胞和免疫细胞的广泛复杂需求，保障人类健康安全。

  中国医学科学院/北京协和医学院输血研究所副研究员， 研究生导师。博士毕业于中国科学院水生生物研究所，2007~2013年在美国进行访问学者及博士后研究。回国后主要研究领域为干细胞生物学和再生医学，主要运用分子遗传学手段在人类胚胎干细胞共培养体系模型中研究人类造血发生过程中的分子调控机制。建立了一系列重要造血相关基因过表达或沉默的多能干细胞系并摸索最优诱导分化模式，同时运用各种方式来进行功能筛选以发现新的造血相关基因，以最终提高体外造血分化效率及品质。同时也开展细胞治疗及基因治疗研究，为未来基因治疗/细胞免疫治疗/干细胞治疗搭建通用平台。已发表论文共30篇，授权国家发明专利2项。

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